【江莱生物-老牌Elisa试剂盒厂家】

【江莱生物-老牌Elisa试剂盒厂家】 2014-10-13 16:48:36

实验原理

以抗细胞因子单抗包被酶联板,与标本中相应的细胞因子特异性反应,然后加入生物素抗生物素放大的酶标抗细胞因子抗体,再经酶底物显色,颜色深浅表示细胞因子量的多少。

elisa试剂盒与器材

抗细胞因子单抗

生物素1抗细胞因子抗体

抗生物素-酶

细胞因子标准品

底物(OPD或TMB)

终止液(2N硫酸)

96微孔板

稀释液和洗涤液

包被缓冲液(0.05mol/L,pH9.6的碳酸盐缓冲液)

酶标仪

操作步骤

1、用包被缓冲液稀释抗细胞因子单抗,浓度为10μg/ml,包被96孔板,每孔加100μl,4℃包被过夜,次日用洗液洗包被板3次。

2、每孔加1%BSA-PBS封闭液200μl,室温封闭2h,用洗液洗3次。

3、标准曲线的建立:标准品用样品稀释液倍比稀释,范围为1000;500;250;125;62.5;31.25;15.6(pg/ml),每孔加100μl,每一稀释度须做双复孔。标准品通常储存在-30℃或冷冻干燥后4℃保存,溶解后须一次用完。

4、检测标本可作适当稀释,每孔加入100μl,每一样本建议做双复孔。同时设正常对照和空白对照。

5、37℃孵育1h或室温孵育2h,然后洗板3-5次。

6、每孔加生物素-抗细胞因子抗体100μl,37℃孵育1h或室温孵育2h,然后洗板3-5次。

7、每孔加抗生物素-酶100μl,37℃孵育30min,然后洗板3-5次。

8、每孔加底物100μl,37℃避光孵育20min。

9、每孔加终止液50μl,酶标仪读取A492值(OPD)或A450(TMB)。

注意事项

一、标本的采取和保存

1、血清标本应避免严重溶血,否则可能会增加非特异性显色。

2、血清应避免细菌污染,否则会因菌体中的内源性HRP而产生假阳性反应。

3、许晴如浑浊或沉淀应离心沉淀后取上清检测。

4、标本宜在新鲜时检测。若5d内检测,可使用冰箱2-8℃保存,超过一周时间测定,应于-20℃低温冻存。样本的长时间保存应在-70℃以下。

二、elisa试剂盒准备

从冰箱中取出elisa试剂盒,等待温度与室温平衡后在使用。否则可能会造成后面温育时间不够,其直接的后果是一些弱阳性标本出现假阳性。

三、加样及反应试剂:

加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡。

四、孵育

孵育是elisa测定中影响测定成败最为关键的一个因素。常用的孵育温度和时间有37℃ 1-2h和4℃过夜。较高的孵育温度下,反应时间可缩短,但对分子含量少的弱阳性标本有漏检的可能。因此,建议elisa检测时尽量使用较低温度孵育较长时间。如果需要使用较高孵育温度,尽量采用水浴,孵育时让酶标板浮于水面上,或将浸透水的纱布置于饭盒中使成一湿盒,放于温箱中。

五、洗板

每次孵育后洗板是否彻底,与特异背景显色有很大的关系,所以洗板一定要认真仔细。

六、显色

加入底物A液和B液前应分别混匀,弃去第一滴,加入后应振荡混匀。

1、显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂。

2、加显色剂时应避免其外流。

3、A、B液应避免接触金属器械。

4、在加入底物开始显色反应前,最好是先检查一下底物溶液的有效性,即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或Eppendorf管中,观察是否有显色反应,如有,则说明底物已变质。

七、读板

1、读板时应保证酶标板清洁。

2、读板时,一定要注意酶标仪是否已调至合适波长。

3、如有条件,建议尽量采用双波长比色,这样可排除有酶标板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响。



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